在阅读此文前，诚邀您请点点右上方的“关注”，既方便您进行讨论与分享，还能及时阅读最新内容，感谢您的支持。
为了在有限的生存空间获得生存优势，微生物进化出了多种生物大分子机器，包括I-X型分泌系统（TISS-TXSS）。
微生物借助天然的分子机器将小分子、蛋白质或DNA分泌到胞外环境或靶细胞内，进而调节与宿主间的互作、抑制微生物生长或直接裂解微生物，使自身成为优势菌群。
在革兰氏阴性菌中，根据组装位置，可分为位于细菌内膜的分子机器（如Sec分泌系统）、位于细菌外膜的分子机器（如T5SS）和同时位于细菌的内膜和外膜的分子机器（如T6SS）。
2006年，T6SS由Mekalanos等人在霍乱弧菌和铜绿假单胞菌中首次发现，是一种主要依赖接触进行攻击的分子武器。
随后大量的研究表明T6SS是一种在革兰氏阴性菌中广泛存在且高度保守的蛋白分泌系统。
2021年，沈锡辉等人发现假结核耶尔森菌T6SS-3通过分泌具有DNA水解酶活性的Tce1，可实现非依赖接触的杀伤靶细胞，扩展了该领域对T6SS功能的认识。
同时，他们还鉴定出细菌的多个T6SS效应蛋白，例如YezP、TseZ、TseM和TssS，通过介导离子转运，调节其致病性。
本文将围绕T6SS核心元件结构与组装、效应蛋白的结构与装配及其相应的免疫机制进行讨论，为后续T6SS组装和功能的研究提供参考。
T6SS结构与组成T6SS是一个纳米级长可收缩的双层管状结构，通过刺穿分泌效应蛋白使细菌在与其他原核竞争或与真核细胞相互作用时具有优势，从而促进细菌的生存与发展。
经典的T6SS（canonical T6SS）是由13个核心蛋白组成，主要分为跨膜复合物、基底复合物和管鞘复合物，而非经典的T6SS（non-canonical T6SS）缺失了跨膜复合物。
Durand 和Rapisarda等人分别解析了肠集聚性大肠埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）中T6SS的跨膜复合物结构。
该复合物是1个C5对称结构，由锚定在细胞外膜的脂蛋白TssJ招募内膜蛋白TssL和TssM组成，每个对称单元包括3个TssJ、2个TssL和2个TssM。
冷冻电镜结构还显示TssJLM复合物不仅作为T6SS装配的支点来招募基底复合物；5个对称单元还形成了1个空腔管道，用于输送效应蛋白。
另外，Rapisarda等人还发现位于空腔管道内侧的5个TssM的loop区776-786会形成1个周质门，正常条件下，该门处于关闭状态，以此防止胞内物质的溢出和有害物质的进入；它的打开可能与T6SS分泌有关，但具体的开合机制仍然有待研究。
基底复合物由VgrG蛋白（Valine-Glycine Repeat Protein G，VgrG）、PAAR蛋白（Proline-Alanine-Alanine-Arginine，PAAR）和TssEFKG复合物组成。
研究显示VgrG三聚体和锥形PAAR蛋白装配在管鞘复合物前端，通过刺穿靶细胞，辅助T6SS有效地分泌效应蛋白；而6个TssKFGE复合物形成的楔子结构则对称地分布在VgrG/PAAR复合物外围，通过与VgrG和蛋白TssL/TssM相互作用，将基底复合物链接到跨膜复合物上。
每个TssKFGE复合物是由6个TssK、2个TssF、1个TssG和1个TssE组成；主要通过TssK和TssL/TssM相互结合，使基底复合物固定在膜上。
管鞘复合物是由数百个Hcp蛋白（Hemolysin Coregulated Protein，Hcp）形成的内管和TssB/TssC（北京大学A/北京大学B）复合物形成的外鞘构成；内管装置是由Hcp六聚体组成的内环堆叠而成，外鞘装置则是由6个TssB/C异源二聚体组成的外环聚合而成。
Hcp与VgrG相结合可能启动了内管的合成；同时TssE/TssF/TssG能够与外鞘蛋白TssB/TssC结合，稳定T6SS结构。
蛋白TssA和TagA分别调节T6SS外鞘组装的起始和终止。
2020年Stietz等人发现霍乱弧菌的TssM除了具有结构蛋白的功能外，还可作为TssA-TssM-TagA模块中一员，参与调节外鞘装置的终止。
另外，Liang等人发现在霍乱弧菌中效应蛋白对T6SS正确装配是至关重要的，效应蛋白的敲除后，T6SS装配显著地减少。
在未知信号的刺激下，外鞘TssB/C复合物通过构象变化，将内管、VgrG/PAAR复合物及效应蛋白输送到胞外或相邻的靶细胞内；外鞘收缩后，ATP蛋白酶ClpV特异性识别TssC的N端暴露出来的α螺旋，将TssB/C复合物解聚成单体，以供循环利用。
目前仍有部分机制尚不清楚，如作为连接跨膜复合物和管鞘复合物的桥梁，基底复合物是怎样将T6SS的各个核心元件组装起来的，各个核心元件又是被怎样调控来起始组装的，这些问题亟待解决。
VI型分泌系统的结构示意图PAAR-VgrG-效应蛋白在T6SS装配中的核心作用由于T6SS组装和分泌的过程中都需要消耗大量的能量，那么宿主微生物是如何降低由T6SS错装或漏装等无效装配导致的能量的消耗？效应蛋白又在T6SS组装中扮演着怎样的角色？Liang等人在2019年发现霍乱弧菌中存在一种“登机检查”机制，能够确保效应蛋白的有效装配和递送。
研究发现与野生型相比，同时敲除基因tseL/vasX/vgrG3明显降低了T6SS装配效率和Hcp的分泌水平；而当只突变效应蛋白的活性位点时（tseLD425A/vasXΔC16/vgrG3D842A），T6SS装配活性和Hcp的分泌水平并未受到影响。
以上结果说明T6SS正确组装和分泌依赖于效应蛋白的物理存在而非其毒性，这可能与效应蛋白参与调控T6SS装置的稳定性有关。
这一结论也在Wu等人的植物致病菌根癌农杆菌T6SS研究中得到验证。
2021年Liang等人发现在致病性达卡气单胞菌中同时敲除基因tseP、tecI和tseC会破坏Hcp分泌，当回补其中任何一个效应蛋白，都可以部分恢复Hcp的分泌和抗菌性；而当同时将3个效应蛋白的活性位点失活（tsePE663A、tseIHFH-AAA和tseCΔ14，即3effc），3effc突变株的T6SS依然可以正常分泌Hcp，但是失去其抗菌性；研究还表明T6SS合成对VgrG异源三聚体的依赖性是由其运载的效应蛋白组合决定的。
同年他们还发现TseP和TseC能够与T6SS核心元件TssK和TssA相互作用。
这些结果进一步表明效应蛋白对T6SS正确装配的重要性，并且其与TssK/TssA相互作用可能参与维持T6SS的稳定性。
有趣的是，Liang等人将致病性达卡气单胞菌的VgrG3的C端嵌入了霍乱弧菌VgrG2的效应蛋白识别序列（VgrG3VC-2TL），同时在达卡气单胞菌中表达霍乱弧菌的效应蛋白VasX，发现达卡气单胞菌T6SS可以将异源效应蛋白VasX分泌到姐妹细胞中。
这为以后开发T6SS应用价值提供了理论基础。
2023年Liang等人开展了PAAR在T6SS装配的机理研究，发现在达卡气单胞菌中单独敲除基因PAAR或vgrG都不会影响T6SS的杀菌活性；但同时敲除PAAR和vgrG则会显著地下调其功能，这表明PAAR协同VgrG在T6SS功能上具有不可或缺的地位；研究还表明位于T6SS主基因簇的PAAR/vgrG与辅助基因簇的PAAR/vgrG相比更加重要。
以上研究表明PAAR-VgrG-效应蛋白复合物在T6SS装配及功能上极其重要，但其详细的作用机制有待进一步的阐明。
T6SS效应蛋白的装配机制T6SS效应蛋白的装配革兰氏阴性菌通过T6SS分泌的效应蛋白来参与微生物间的生存竞争。
目前针对细菌类或真核类的效应蛋白主要分为5种，分别是（1）可降解细胞壁的毒素，如霍乱弧菌中VgrG3]和铜绿假单胞菌中Tse1及Tse3；（2）可破坏细胞膜的毒素，如霍乱弧菌中TseL和VasX；（3）可降解细胞质内物质的毒素，如Rhs（Rearrangement hotspot）家族蛋白，包括致病性达卡气单胞菌的TseI和西瓜嗜酸菌中RhsB等；（4）生长抑制类毒素，如铜绿假单胞菌中Tse2和Tse6等；（5）介导金属离子转运的毒素，如铜绿假单胞菌的TseF和Azu]等。
革兰氏阴性菌的效应蛋白主要通过两种方式装载到T6SS上，分别是共价结合和非共价结合。
效应蛋白通过共价键结合的方式，将毒素结构域融合在T6SS的结构蛋白（Hcp、VgrG和PAAR）上，使其具备了结构蛋白和毒性蛋白的双重功能。
Mougous和Noreen等人解析的铜绿假单胞菌和空肠弯曲菌Hcp蛋白结构中6个Hcp组成直径约40Å的内环。
结构分析表明位于Hcp六元环的顶部和底部氨基酸高度保守，主要介导了与其他Hcp的聚合作用，参与内管结构的延伸；而位于Hcp六元环的内外侧上的氨基酸保守性则比较差，推测Hcp环内氨基酸的多样性可能与携带的毒素有关。
Ma等人发现肠集聚性大肠埃希菌中Hcp蛋白都融合了1个延伸的C端毒素区（Extension Toxin，ET结构域），主要分为5种，分别是Hcp-ET1到Hcp-ET5。
肠集聚性大肠埃希菌的T6SS2特异性分泌Hcp-ET1，进而利用Hcp-ET1降解核酸物质的活性，导致靶细菌死亡；而任意敲除肠集聚性大肠埃希菌的基因hcp2A/hcp2B都会导致该菌株丧失抗菌性。
研究还表明Hcp-ET1可能与Hcp2A和 Hcp2B蛋白形成异源六聚体，将ET1结构域包裹在内管中，完成T6SS毒素的装配。
由于还未解析Hcp-ET1-Hcp2A-Hcp2B复合物的结构，ET1结构域与Hcp2A/Hcp2B形成的环内氨基酸的具体作用机制还有待挖掘。
VgrG是T6SS重要组成元件，可通过在C端会融合毒素区成为专属效应蛋白。
霍乱弧菌主要包含3种VgrG，分别是VgrG1、VgrG2和VgrG3，VgrG1和VgrG3分别包含具有肌动蛋白交联活性（ACD）和水解肽聚糖的活性的C端功能域。
在T6SS组装的过程中，VgrG聚合形成1个异源三聚体，其中VgrG2是组成T6SS必不可少的结构蛋白。
在嗜水气单胞菌中，编码vgrg1的基因位于T6SS基因簇外的细菌染色体上，融合ADP-核糖基转移酶活性的功能域的VgrG1可作为效应蛋白行使功能。
迄今为止，关于霍乱弧菌介导VgrG组成特定的异源复合物的机制以及嗜水气单胞菌中不同VgrG蛋白的相互作用仍需要继续探索。
效应蛋白也可以通过非共价键的方式装配到T6SS装置的不同部位，这类蛋白被称为货物效应蛋白。
如铜绿假单胞菌中通过与Hcp1蛋白相互作用，被包裹在H1-T6SS内管的效应蛋白Tse1-4（10-30 kDa）。
研究表明Hcp1通过不同的氨基酸残基参与Tse家族蛋白的分泌：氨基酸Thr-59和Ser-115同时介导了Tse1-4的分泌；氨基酸Leu-28、和Ala-29 同时参与了Tse2和Tse3的分泌，氨基酸Ser-31只参与了Tse2的分泌。
虽然Hcp上参与分泌Tse的关键氨基酸已被鉴定出，但Tse蛋白在纳米级长的Hcp内管中的作用机制还不清楚。
未来有关Hcp-效应蛋白复合物的结构研究可能会有助于了解T6SS内管的毒素装配。
除了借助T6SS内管运输外，效应蛋白也可以通过与VgrG结合，将其装载到T6SS上。
Flaugnatti等人在2020年用单颗粒冷冻电镜的方法解析了肠聚合性大肠杆菌中(VgrG)3-(Tle1)3复合物三维结构，首次揭示了效应蛋白Tle1与VgrG（DUF2345和TTR结构域）之间的相互作用。
结构显示3个Tle1分子与VgrG三聚体结合形成异源六聚体，其中每个Tle1都会同时与3个VgrG的不同区域相互作用，分别依附在VgrG三聚体的侧面，最终实现效应蛋白的装配。
但该复合物中Tle1是否会与T6SS的其他蛋白相互作用，以及分泌到靶细菌的Tle1又是如何从复合物上解离并发挥其磷酸酶活性的分子机制仍需要继续探索。
货物效应蛋白可在分子伴侣Tec/Tap家族（即含DUF4123结构域蛋白）的帮助下，通过VgrG/PAAR核心元件，装配到T6SS上。
2015年，Liang等人首先在霍乱弧菌中发现T6SS效应蛋白TseL 的分泌需要分子伴侣VC1417（TecL），并证明分子伴侣TecL通过与结构蛋白VgrG1和效应蛋白TseL 相互作用，辅助效应蛋白TseL的装配。
同时，他们也鉴定并验证了嗜水气单胞菌效应蛋白TseC的分子伴侣TecC，发现效应蛋白TseC的递送需要VgrG1和TecC的参与。
之后，Bondage等人发现在根癌农杆菌中，核酸酶Tde1只有在结合了Tap-1之后才能被VgrG1识别并装配到T6SS上。
基因tap-1的敲除明显地降低了细胞内Tde1蛋白稳定性及其分泌水平，但不影响T6SS组装及其他效应蛋白Tae的分泌，这说明Tap-1不仅特异性的辅助Tde1结合VgrG1，也参与调节Tde1蛋白的稳定性。
有趣的是，研究还发现PAAR蛋白可以明显提高Tde1分泌效率和抗菌性，但由于缺乏对Tde1-Tap-1-VgrG1复合物和Tde1-Tap-1-VgrG1-PAAR复合物结构的研究，目前并不清楚这两种复合物在T6SS分泌Tde1的作用原理。
效应蛋白也可以在分子伴侣Eag家族（即含DUF1795结构域蛋白）的帮助下，通过与VgrG蛋白相互作用，装配到T6SS上，如专属效应蛋白PAAR。
PAAR效应蛋白通常含有多个结构域，如prePAAR基序（包含一段AARxxDxxxH氨基酸序列）、跨膜结构域（transmembrane domain, TMD）、Rhs结构域和毒素区等。
铜绿假单胞菌的效应蛋白Tse6由430个氨基酸组成，包含了2个TMDs、1个PAAR结构域和1个NADase结构域。
Quentin等人发现Tse6的2个TMDs分别结合在EagT6二聚体的疏水性的凹槽上，EagT6-Tse6的相互作用一方面提高Tse6蛋白在胞质的稳定性，防止蛋白聚集降解；另一方面介导了Tse6-VgrG1复合物的形成。
研究还发现EagT6没有伴随Tse6-VgrG1复合物分泌到靶细胞，说明EagT6仅参与了Tse6蛋白的装配。
EagT6-Tse6相互作用模型可能在一定程度上模拟了Tse6跨过靶细胞内膜实现毒素递送的过程，但EagT6是如何从EagT6-Tse6-VgrG1复合物上解离的机制仍然未知。
同时Wu等人在用工程化铜绿假单胞菌DUEC传递Tse6-Cre融合蛋白时，发现Tse6的TMD1在传递过程中是非常重要的，但详细的分子机制还有待进一步的研究。
分子伴侣Eag家族蛋白还可以辅助装配大型的Rhs效应蛋白，包含了prePAAR基序、1个TMD、1个PAAR结构域、1个Rhs结构域和1个毒素区，如RhsA和Rhs1。
Photorhabdus laumondii 的VgrG-EagR-Rhs1复合物结构表明两分子EagR1结合1个Rhs1NT，并间接地促进了Rhs1-VgrG1复合物形成。
鼠伤寒沙门氏菌SciW-Rhs1NT复合物结构详细展示二者间的作用网络，首先两分子SciW形成“V”型二聚体，然后Rhs1的N端结构域结合在“V”字口袋区，以非对称的结合模式与两分子的SciW相互作用。
SciW与 Rhs1相互作用能够稳定prePAAR-PAAR的构象，最终促进了Rhs1与VgrG1的相互作用。
研究还发现不同菌群中Rhs-VgrG相互作用机制略有不同，Jurénas和Ahmad等人发现仅RhsNT参与了和VgrG相互作用；而Pei等人的研究表明RhsNT和RhsCT都会与VgrG相互作用，调控着Rhs蛋白的装载。
分子伴侣-Rhs-VgrG复合物结构将为解析分子伴侣在Rhs-VgrG复合物中的作用机制提供十分重要的实验依据。
细菌免疫蛋白抑制毒素作用的机制革兰氏阴性菌T6SS将装配好的效应蛋白借助管鞘复合物收缩将其投递到胞外环境或周围靶细胞（包括姐妹菌群），进而通过效应蛋白作用于靶细胞的不同位点，发挥毒性。
试想T6SS宿主细菌在合成效应蛋白时，自身是如何避免效应蛋白的毒性？抑或是当细菌将毒素投送到姐妹细胞时，受攻击的姐妹细菌又是启动怎样的防御措施呢？研究表明被攻击的靶细菌也进化出多种防御措施，主要分为非特异性抵抗和特异性。
非特异性防御主要通过靶细胞激活体内的某些信号通路，包括细胞外多糖合成通路、包膜应激反应以及普通压力应激信号通路等，从而实现自我保护，而特异性防御主要指靶细菌会合成特异的免疫蛋白，从而抑制效应蛋白的毒性。
革兰氏阴性菌对T6SS毒素的免疫机制特异性中和毒素的作用机制主要体现在特异的效应蛋白-免疫蛋白对。
接下来将从典型的效应蛋白-免疫蛋白复合物结构阐述免疫蛋白的抑制机理。
铜绿假单胞菌的Tse1-Tsi1复合物结构表明Tsi1以1:1分子比结合在Tse1底物催化区。
Tse1单体和Tse1-Tsi1复合物的结构比对分析表明Tsi1的结合并没有改变Tse1三维构象，而是以一种“钥匙-锁”的相互作用模型，发挥其中和毒素的作用，这一作用模式也适用于铜绿假单胞菌Tsi3对Tse3的免疫机制。
在解析的Tse3-Tsi3复合物结构中，Tsi3的3个柔性loop区同样结合在Tse3底物结合区（“Y”活性位点），同时不诱发Tse3产生较大的构象变化。
另外，研究还发现钙离子对Tse3催化活性以及Tse3与Tsi3相互作用都非常重要。
免疫蛋白也可通过形成空间位阻，影响效应蛋白的活性位点与底物的相互作用，达到抑制毒素的作用，例如铜绿假单胞菌Tsi2免疫机制。
2013年Robb等人解析了Tse2-Tsi2复合物结构，Tsi2二聚体结合2个分子Tse2，通过特异性的氢键和电荷间相互作用，形成了稳定的2:2异源四聚体。
结构中Tsi2没有直接与Tse2活性位点（Arg-14, Ser-80, His-122）相互作用，但通过空间位阻，使Tse2无法结合底物。
另外，研究还表明Tse2催化活性区的氨基酸序列是高度保守的，而与Tsi2相结合的氨基酸序列并不保守，存在特异性，这也侧面说明了Tsi2的免疫机制具有种群特异性。
Zhang等人解析的固氮阴沟肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的Tae4-Tai4复合物结构揭示了Tai4抑制机制与Tsi2相似。
同时StTae4-EcTai4复合物结构表明，虽然StTai4和EcTai4氨基酸序列的同源性不高，但都形成了相似的三维结构，因此可以结合同一类的毒素（Tae4）。
这也解释了不同微生物之间的交叉免疫机理。
另外，2018年Ting等人解析了变形斑沙雷氏菌Tre1-Tri1复合物结构，发现Tri1具有双重的免疫机制，除了通过与Tre1催化位点Glu-415相互作用抑制毒性外，还可通过移除Tre1对FtsZ的ADP核糖修饰，发挥免疫的作用。
除了上述免疫机制外，T6SS宿主细菌还可利用效应蛋白自身的结构特征来抑制其毒性，这类效应蛋白通常含有多个结构域。
霍乱弧菌VgrG1的肌动蛋白交联结构域结构呈²V²字型。
该结构表明VgrG1的N端和VgrG1的肌动蛋白交联结构域之间的loop区具有重要的生物功能。
正常情况下，这段无序的loop区会结合²V²型的空腔区，封锁其活性位点，起到自我保护的功能；当ATP和二价阳离子（Mg2+或Mn2+）存在时，此时这段无序的loop区会发生偏转，离开空腔区，从而激活VgrG1催化活性。
还有Günther和Jurénas等人解析的效应蛋白Rhs的冷冻电镜结构，该蛋白中心区Rhs会形成1个β-桶状结构，将C端毒素区嵌入桶内，而N端和部分Rhs区分别形成桶的顶盖和底盖，从而使其毒素区与底物分开，最终实现自我保护。
近年来，研究者运用X射线晶体衍射学和冷冻电镜技术已经解析了T6SS部分核心复合物的三维结构，了解主要结构蛋白在T6SS装配中的位置与功能；但至今还未解析完整的T6SS结构。
猜测这可能与各个复合物连接处的蛋白间相互作用力的强弱有关。
T6SS是由14-20个蛋白组成的复杂的分泌系统，各个组件装配的顺序和核心复合物连接区蛋白的结构仍需要大量研究工作。
另一方面，效应蛋白可以作为T6SS骨架蛋白或与骨架蛋白相互作用装配到该分泌系统上，目前只有极少数的效应蛋白-结构蛋白复合物结构被解析出来，仍有大量的效应蛋白的结构与功能，以及其装配机制需要进一步探索。
这方面的研究成果将有助于人们对T6SS认识，同时为T6SS应用奠定基础。
另外，虽然已经解析了部分免疫蛋白-效应蛋白复合物的三维结构，但免疫蛋白与效应蛋白特异的毒素中和机制还有待发掘，这将为以后研制靶向药物或抗生素提供基础。
COSTA TR, FELISBERTO-RODRIGUES C, MEIR A, PREVOST MS, REDZEJ A, TROKTER M, WAKSMAN G. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights[J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13(6): 343-359.LASICA AM, KSIAZEK M, MADEJ M, POTEMPA J. The type IX secretion system (T9SS): highlights and recent Insights into its structure and function[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiololy, 2017, 7: 215.PALMER T, FINNEY AJ, SAHA CK, ATKINSON GC, SARGENT F. A holin/peptidoglycan hydrolase-dependent protein secretion system[J]. Molecular Microbiology, 2021, 115: 345-355.MOUGOUS JD, CUFF ME, RAUNSER S, SHEN A, ZHOU M, GIFFORD CA, GOODMAN AL, JOACHIMIAK G, ORDOÑEZ CL, LORY S, WALZ T, JOACHIMIAK A, MEKALANOS JJ. A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus[J]. Science, 2006, 312(5779): 1526-1530.