今日推送的文章是发表在Angewandte Chemie International Edition上的“A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates”，通讯作者为中国科学院南海海洋研究所张丽萍副研究员与张长生研究员。
非活化碳氢化合物的位点特异性氧化可以赋予有机化合物结构复杂性和高价值，而多功能P450可以催化底物C-H键的区域/立体/化学选择性氧化，在制药和生物制造的快速结构修饰中发挥着重要作用，但是控制多功能P450的区域选择性和化学选择性的反应机制仍然不是很清楚。
PoTeMs类天然产物是含有一个吡咯烷-2,4-二酮(tetramate)和一个稠合多元碳环的大环内酰胺类化合物，包括5/6/5型ikarugamycin、5/5/6型pactamides和comamides等。
PoTeM碳环包含数十个潜在的碳氢化合物活化位点，但不同P450具有显著的区域选择性和化学选择性。
P450 IkaD催化ikarugamycin (1)中C7=C8双键的环氧化，形成环氧化karugamycin (1a)，以及随后的C29羟基化，形成capsimycin G (1b)；而CftA(与IkaD具53%的序列同一性)也以1为天然底物，但催化C29位四电子氧化，形成C29-酮基化的clifednamide A (1c)，并进一步微弱催化C30羟基化，产生clifednamide C (1d)此研究中，作者用共同的PoTeM底物ikarugamycin解析了IkaD和CftA配合物的晶体结构，直接比较了解结构-功能关系，并通过微调极性口袋来改变IkaD的区域选择性。
通过生化实验研究了IkaD和CftA的底物柔韧性，并通过与非天然底物的配合物的结晶体结构来支持其潜在的机制。
这些发现为控制多功能P450的位点选择性、反应顺序和氧化模式的结构参数提供了全面的见解，并将启发未来P450酶的选择性碳氢化合物活化工程。
图1 细胞色素P450s IkaD和CftA在PoTeMs上的区域选择性和底物灵活性1.IkaD和CftA的F/ g区构象不同作者首先解析了IkaD和CftA与共同底物1的复合物晶体结构。
蛋白整体符合P450酶三角形骨架，IkaD和CftA的底物结合口袋以长i -螺旋为壁，血红素辅助因子为底，B/ c -环和F/ g -螺旋区域为盖但IkaD和CftA的FG区域的构象明显不同。
IkaD的F/ g区下移到活性位点，g -螺旋的n端移动- 4 Å，且IkaD (I291-F295)的β5环从活性位点旋转了5°Å(图2A)。
因此，IkaD和CftA的底物结合空腔在形状上有显著差异。
图2 IkaD与CftAe和 ikarugamycin(1)结合晶体结构的比较。
底物1的取向决定了区域选择性和化学选择性在IkaD和CftA的底物结合口袋中，底物1在IkaD和CftA中的血红素平面方向不同:1的A/B环在IkaD中几乎平行于血红素平面，而1在CftA中几乎垂直于血红素平面。
在IkaD中，1的C7=C8 π轨道位于血红素Fe中心的正上方，由于C8=C7上C-H键比C29位C-H键更活泼，所以IkaD优先催化C8=C7环氧化，再迅速催化C29位羟化，且C-H键的朝向与产物中C8-C7环氧和C29-OH的立体构型一致。
而由于底物1与CftA中的血红素Fe呈垂直构象，因此其末端的乙基(C30 C29)直接指向血红素Fe中心的上方(图3D)。
这种取向使得C29处于最短距离，这种距离/角度特征与CftA优先催化C29位再微弱催化C30位一致。
图3 分析ikarugamycin(1)在IkaD和CftA中的结合通过四甲酸盐和内酰胺部分的结合来控制底物的取向作者接下来研究了IkaD和CftA如何以不同的取向结合共同的PoTeM底物1，以发挥区域选择性和化学选择性氧化作用。
作者发现在IkaD中，封闭的F/ g区(A177-R193)的压缩力将1的极性四甲酸基和内酰胺基推向i -螺旋(E232-A263)和B/ c -环(F72-P100)(图2A和3a);而在CftA中，F/ g区(A165-E181)采用更开放的构象，对四聚物和内酰胺基团1缺乏压缩力，因此远离i -螺旋(E222-V251，图2A和3B)。
因此，1的极性四甲酸基和内酰胺基与IkaD中的R86、R90、D241和S244侧链形成丰富的氢键(图3A)，而与CftA中相应的残基R74、R78、D229和I232不形成氢键。
此外，CftA中β5环的F283通过与1的5/6/5-碳环的疏水相互作用形成范德华力(图3B)，而IkaD中对应的F295则随着β5环的翻转而旋转离开活性位点(图3A)。
在IkaD中，1从“更封闭”的f -螺旋中与I180和L181形成额外的疏水相互作用。
以上结果说明两种酶的构象差异导致保守残基的作用不同，特别是那些负责结合四甲酸基和内酰胺基1的极性残基。
为了验证极性残基R86、R90、D241和S244在IkaD中的作用，作者构建了一个四甲酸基和内酰胺基与底物1结合的子口袋突变体文库并进行丙氨酸扫描，其中，与IkaD催化的1到1a和1b的转化不同，IkaD突变体R86 K、D241 A和S244 A主要形成了新产物29-羟基伊卡拉甘霉素(1c′)(图3G)。
作者认为，IkaD中极性残基的诱变可能会引起活性位点1的轻微摆动。
由于1在IkaD中采用“平行构象”(图3C)，因此很可能由于1的轻微摆动，使得1的C29比C8更接近血红素Fe反应中心，从而导致相应的IkaD突变体R86K、D241A和S244A在C29处更有利于氧化。
以上结果表明IkaD和CftA的F/ g区的不同构象导致两种p450中1的四聚氨基甲酸酯和内酰胺部分的不同结合模式。
这些结合差异导致同一底物在IkaD和CftA中取向不同，最终导致功能不同。
IkaD和CftA对非天然PoTeM底物的底物灵活性作者还系统测试了IkaD和CftA对不同类型多元碳环的PoTeMs的体外活性，发现二者均具有一定的底物宽泛性，但位点选择性有差异，同时发现IkaD的活性更高。
图4 IkaD和CftA在5/5/6型(A)、5/6型(B)和5/5型(C) potem上的反应与非天然底物反应的结构基础为了了解IkaD和CftA在非天然底物上识别和不同反应的结构基础，作者进一步解析了IkaD与两个5/5/6型碳环骨架底物，以及CftA与一个5/5型底物的复合物结构(图5)。
作者发现不同底物并没有诱导IkaD和CftA的构象变化，二者的FG区域构象差异保持，并最终决定了对5/5/6型和5/5型底物的位点选择性和反应顺序。
与1的体外反应结果类似，R86K、D241A和S244A这些远离heme Fe反应中心的突变也显著改变了IkaD催化5/5/6型的反应位点，从而得到了新产物2c和2d.图5 IkaD和CftA对非天然底物的结合总结: 通过晶体结构的比较分析，作者揭示了IkaD和CftA对其共同的PoTeM底物ikarugamycin具有不同区域和化学选择性的机制。
结果分析表明，IkaD和CftA中不同的F/ g区构象导致同一底物1相对于血红素Fe反应中心的取向不同，这决定了氧化位点和氧化顺序。
在IkaD中，1的A/B碳环几乎平行于血红素Fe，暴露出C8是最活跃的位点，C29是第二活跃的位点，与观察到的氧化顺序一致。
在CftA中底物1几乎垂直于血红素Fe，使得C29是最接近氧化的位点，其次是C30，与CftA对底物的氧化顺序一致。
四酸酯和内酰胺基团的结合有助于将A/B碳环定向到血红素Fe上。
作者通过诱变结合四酸酯和内酰胺基团的残基，产生了几个具有改变区域选择性的IkaD突变体，从而高度揭示了微调活性位点以重新定位底物和改变反应位点或序列的潜力。
最后，作者还通过生化测试、复合物结构解析和突变发现这种机制适用于非天然底物复合物。