阅读文章前，辛苦您点下右上角的“关注”，方便您讨论分享，持续关注每日优质内容~花旗松素（Taxifolin，TFL）又名二氢槲皮素，是一种具有多种天然活性物质的二氢黄酮类化合物。
自然界中，广泛存在于落叶松、水飞蓟、红蓼、洋葱和黄芪等多种松科与蔷薇科的植物中，其中以落叶松中含量最高，根茎部尤甚。
常用的提取方法包括：热水浸提法、乙醇回流法、酶诱导法、超声法和有机溶剂萃取法等。
未来也可能通过构建基因工程菌株大规模发酵生产花旗松素。
因花旗松素结构中含有较多的酚羟基，可表现出多种生物学活性与较强的抗氧化作用，现已研究发现其含有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射及抗心血管系统疾病等功能，具备开发为防腐剂、保健品和食品的潜力。
此外，于2021年4月，花旗松素已被我国卫健委认定为“新食品原料”，可见其市场前景十分广阔。
白屈菜红碱（Chelerythrine，CHE）是一种苯并菲啶型生物碱，具有抗炎抑菌、抗肿瘤、防治虫害等生物活性。
目前研究发现白屈菜红碱对多种典型病虫害都具有显著抑制作用，具备开发生物防治农药的潜力，用于减轻作物病害。
但因单独使用该药物抑菌所需浓度较高，因此若能找到其他抗菌剂与之联合使用，将降低药量并增强抑菌活性，提升产品性能。
已有研究表明，生物碱和黄酮类化合物都具有高效抑菌能力。
因此，本实验将白屈菜红碱与花旗松素联合使用观察其抑菌能力是否增强。
基于此，本研究取材落叶松根茎部，采用超声辅助乙醇热浸提法提取花旗松素，经醚类萃取、重结晶技术进行纯化，测定其纯度与提取率，研究其对革兰氏阳/阴性菌的抑菌能力和机理，并与白屈菜红碱联用进行了药物联合抑菌实验，探究其抑菌效能，以期为未来食品、日化及医药领域的产品开发与行业发展提供理论基础。
材料：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aeruse），均来自东北林业大学微生物学科菌种保藏中心。
过氧化氢酶试剂盒、过氧化物酶试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒，购自苏州格锐思生物科技有限公司。
试剂：花旗松素（标准品），购自上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物等购自Oxoid公司；甲醇（色谱级）购自Fisher公司；无水乙醇、甲基叔丁基醚、二甲基亚砜、2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside（ONPG）（邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）等化学试剂均为分析纯级，购自国药集团。
Luria-Bertani（LB）培养基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，NaCl 2 g，蒸馏水200 mL，pH 7.2~7.4，高压灭菌待用。
落叶松：来自大兴安岭；白屈菜红碱（CHE）：来自东北林业大学微生物实验室（纯度98）。
仪器：高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司Agilent 1260；低温高速离心机5430R，德国艾本德公司；透射电子显微镜JEM-2100，日本电子株式会社；紫外分光光度计TU-1901，北京普析通用仪器责任有限公司。
采用超声辅助乙醇热浸提法提取花旗松素。
取200 g落叶松粉末加入2 L 90％乙醇80 ℃水浴2 h后超声（功率300 W）震荡1 h后过滤得滤液，利用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
取第一次提取液加入甲基叔丁基醚1.2 L，匀速搅拌20 min，静止30 min，分离得到甲基叔丁基醚萃取液，此步骤重复3-4次，将其减压浓缩，冻干得粗提物。
再经三次重结晶，冻干得终产物。
准确称取花旗松素标准品（HPLC ≥ 98%）10 mg溶于乙醇中，定容至10 mL，制备成1 mg/mL的对照液，配置浓度分别为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL的标准待测液，用于绘制花旗松素浓度标准曲线。
花旗松素标准液及提取样品均采用高效液相色谱测试，条件如下：柱温30 ℃、流动相40％水：60％甲醇、运行时间10 min、检测波长288 nm、流速1.0 mL/min。
此条件下，花旗松素出峰时间约为（2.672 ± 0.1）min。
根据对应出峰时间的出峰面积，将其带入花旗松素浓度标准曲线得到样品纯度。
另取适量花旗松素产物溶于去离子水，采用紫外分光光度计对其进行全光谱扫描，验证提取物为花旗松素。
用0.01 mol/L PBS溶解花旗松素，加入适量LB液体培养基，配制终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的花旗松素溶液，分别加入培养至对数生长期的E. coli、S. aureus菌液80 μL，终体积8 mL。
各管充分混匀后置恒温培养箱37 ℃ 130 r/min震荡培养。
24 h后取各组菌液测定OD600值。
抑制率＞80%所含最低药物浓度为最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。
分别在培养至对数生长期的E. coli、S. aureus菌液中加入终浓度为0 MIC、1/2 MIC和1 MIC的花旗松素溶液，每组设置三个重复，混匀后置于37 ℃培养箱，130 r/min震荡培养，于1、2、4、6、8、10、12和24 h分别取样测定600 nm处吸光值[14]，绘制生长曲线。
另取适量菌液通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态变化，样品处理方法参照Wang等。
培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与添加终浓度为1 MIC的二氢槲皮素培养至12 h、24 h。
放入离心管中（设置三组管）离心后倒去上清液并收集大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌泥与经二氢槲皮素处理后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌泥。
先将盖玻片用纯水和无水乙醇分别超声清洗15 min，将离心后菌泥接触到盖玻片上并均匀分散，等自然晾干，之后加入适量的3%戊二醛固定液将样品全部覆盖后放置-4℃冰箱固定12 h。
使用先配置乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%（每次浓度重复3次，更有效脱水作用）进行乙醇浓度梯度脱水，每次震荡脱水10-15 min即刻。
之后保存样品于-4℃冰箱样品自然晾干待测。
采用分光光度法测定花旗松素处理后菌体内大分子物质含量，以评价菌体被破坏的程度。
将培养至对数期的菌体通过8000 r/min离心10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次并重悬，分别加入花旗松素使其终浓度为1/2 MIC、1 MIC、2 MIC，以无花旗松素的细菌培养液为对照，放置于37 ℃摇床130 r/min振荡培养，于1、4、8、24 h取混悬样液1 mL，8000 r/min离心10 min，取上清适当稀释后，立即于260 nm和280 nm测定吸光值，每组重复三次。
参照吴海霞方法。
制备待测菌液，分别加入不同浓度梯度的花旗松素（1/2 MIC 、1 MIC、2 MIC）设置三组平行，再加入 1 mg/mL的ONPG（邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）混匀，37℃水浴，每隔1 h测于紫外分光光度计405 nm的吸光值OD2 （共测4个小时时间段）。
阴性对照为加入缓冲液，吸光度值为OD1。
细胞质膜渗透性增加导致的吸光度值为OD=OD2-OD1 。
重悬待测菌液，分别加入不同浓度花旗松素，使其终浓度为2 MIC，每组设置三组平行充分混匀，37℃水浴孵育1 h后离心，取上清液再加入 1 mg/mL的ONPG（邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），37℃条件下再水浴孵育4 h，后测在OD405 nm 的吸光度值OD2。
细菌经超声波破碎（冰浴，功率200 W，超声5 s，间隔5 s）离心后取上清液，测吸光度值OD1作为阳性对照。
上清液中β-半乳糖苷酶相对活性为=OD2/OD1×100%，通过分光光度计测定β-半乳糖苷酶水解乳糖类似物ONPG产物的特征吸收评价花旗松素对细胞质膜渗透性的影响。
采用材料对花旗松素作用于细菌后的CAT酶、POD酶和SOD酶活性变化进行测定。
取适量培养至对数生长期的E. coli、S. aureus，配置终浓度为1 MIC的TFL溶液，以0 MIC为对照，分别装于2 mL离心管内，每组设置3组平行重复，培养至1 h、4 h、8 h、24 h。
将样品离心后加入1 mL提取液冰浴超声破胞，之后在4 ℃条件下12000 r/min离心10 min，取上清根据试剂盒说明书进行实验。
使用Bliss独立模型计算药物联用作用指数，使用以下其公式计算协同指数：FAB：指在联用药物时细菌的生长速率（24 h测得OD值），A为花旗松素，B为白屈菜红碱。
FA，FB：分别指有A、B时细菌的生长速率；F0：指没用药处理时细菌的生长速率；S：为药物联用作用指数，该参数若为正值，则代表药物联用对菌体具协同作用；负值则呈拮抗作用。
同操作，分别测定菌体的胞内大分子物质泄漏、细菌膜渗透性和抗氧化酶系的变化。
实验中，将花旗松素样品变更为1/4 MIC的花旗松素和1/4 MIC的白屈菜红碱混合液。
采用SPSS 26.0 软件进行数据处理，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
文中图片由Origin 2021软件绘制。
根据高效液相色谱测定不同浓度花旗松素标准品所得峰面积，绘制标准曲线。
据此计算在落叶松中提取所得花旗松素样品纯度为90%。
经紫外分光光度计全光谱扫描，发现样品最大吸收峰值位于288 nm，这与刘丛等研究结果一致，可确定提取物为纯度较高的花旗松素。