«——【·摘要·】——»无花果树具有很高的经济价值。
然而，由于快速软化，它的果实保质期很短。
聚半乳糖尿酸酶是必需的水解酶，负责果胶降解，果胶在果实软化中起关键作用。
然而，无花果PG基因及其调节因子尚未表征。
在这项研究中，在无花果基因组中鉴定出43个FcPG。
它们不均匀地分布在13条染色体上，在4号和5号染色体上发现了串联重复的PG基因簇。
Ka/Ks计算和共线分析表明，负选择是FcPG家族扩展的主要驱动力。
无花果中14个FcPGs表达，FPKM值>10，其中7个与果实软化呈正相关，3个与果实软化呈负相关。
11个FcPG上调，2个下调响应乙烯利处理。
FcPG12是4号染色体串联重复簇的成员，由于其在果实软化过程中转录本丰度急剧增加及其对乙烯利处理的反应而被选中进行进一步分析。
FcPG12的瞬时过表达导致无花果果实硬度降低，组织中PG酶活性增加。
在FcPG12启动子上发现了两个乙烯响应因子结合的GCC盒位点。
酵母单杂交和双荧光素酶测定表明，FcERF5直接与FcPG12启动子结合并上调其表达。
FcERF5的瞬时过表达上调了FcPG12的表达，从而增加了PG活性和果实软化。
我们的研究发现FcPG12是无花果果实软化的关键PG基因，其直接正调控作用为FcERF5。
研究结果为无花果软化的分子调控提供了新的信息。
质地变化是果实成熟的一种特征性、不可逆的现象，伴随着一系列其他生理生化变化，如糖分积累、变色、香气发育等。
这些变化是由一系列果实成熟相关基因的时空表达引起的。
成熟果实的质地变化主要是由于果胶降解，细胞壁松弛和膨胀以及纤维素和半纤维素的分解。
细胞壁多糖的分解涉及多种酶和蛋白质的协同作用，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂解酶、内转糖基酶/水解酶、膨胀蛋白等。
PG是最大的水解酶家族之一，属于糖苷水解酶家族28。
PG基因家族已在许多水果物种中鉴定，包括甜樱桃中的45 PG s，猕猴桃中的51 PG s，葡萄中的35 PG s，梨中的61 PG s和桃子中的45 PGs;在拟南芥中已鉴定出66例PG。
PG家族广泛参与各种组织生长和扩张所需的细胞壁修饰，如芽，叶和根，以及器官脱落。
不同PGs的转录水平直接或间接受内外因素调控，如植物激素、温度和紫外线。
PG家族成员对果实发育和成熟感兴趣。
在石蒜茄属一个由54个成员组成的家族中，有5个PG被鉴定为与果实发育有关。
在猕猴桃中，2个PG与果实成熟密切相关，AaPG18被发现参与猕猴桃成熟过程。
在木瓜中，CpPG1被发现在果实软化中起关键作用[、。
草莓果实软化过程中FaPG1的表达增加，反义FaPG1延缓软化。
在甜樱桃中，PavPG38的瞬时过表达降低了果实硬度以及离子连接果胶和共价果胶含量，并增加了水溶性果胶的含量。
与果实成熟和软化相关的PGs的表达受许多转录因子的调节，包括APETALA2/乙烯反应因子家族转录因子、NAC家族和MADS-box家族。
具有核心序列AGCGCCC的GCC-box通常是一种顺式作用元件，由靶基因启动子上的AP2/ERF蛋白直接结合。
在木瓜中，电泳迁移率转移测定显示CpERF9通过GCC盒基序与CpPG5启动子特异性结合。
敲除番茄中的SlERF52导致剥离层中TAPG1、TAPG2和TAPG4下调。
在桃中，PpERF2直接与PpPG1启动子结合，并在果实软化过程中抑制PpPG1的表达。
无花果是最早驯化的果树之一。
它对种植环境适应性强，并产生可观的经济价值。
无花果果实具有更年期，果实成熟后硬度迅速下降，使其极不耐贮运，阻碍了其作为新鲜水果的使用。
当果实生理成熟并开始软化时，无花果容器和果肉中果胶和半纤维素的含量和状态会发生变化。
果胶增溶与PG和果胶甲基酯酶酶的活性较高有关。
FcPG1和FcPG2的表达模式已被分离和鉴定，但该研究对基因结构和序列的信息不完整，基因的功能也未得到验证。
因此，虽然质构的变化是影响新鲜无花果货架期的重要生物学特征，但对无花果中PG的研究缺乏深入研究，果实成熟和软化的关键PG尚未确定。
FcPG s的染色体位置和系统发育树FcPGs标记在染色体上;左边的比例尺表示无花果染色体的长度。
基因背景的颜色对应于图B的系统发育树中的分支颜色.系统发育树显示了F. carica中43个FcPGs与拟南芥和其他物种中PG s的关系。
右下角的四个彩色三角形表示已鉴定的PG基因的生物学功能本研究分析了无花果实中的PG基因家族和PG表达。
FcPG12是4号染色体上一个小PG簇的成员，被确定为果实软化的关键PG。
发现FcERF5调节FcPG12，激活其转录表达并促进无花果软化。
«——【·结果·】——»以拟南芥PG蛋白序列为查询对象，汇集招募的65个序列，共获得67个PG候选序列;通过检索图基因组数据库的GH28 HHM图谱筛选56个序列，并删除重复序列。
通过CDD数据库检索和基序测试去除缺乏PG结构域特征的蛋白质序列后，鉴定出43个PG。
PG基因根据其在染色体上的位置被命名为FcPG1至FcPG43。
1FcPGs长252-974个氨基酸，计算出的相对分子质量为2.75-10.38 kDa，预测pI为4.86-9.82。
大约一半的FcPG蛋白含有SignalP预测的信号肽序列。
大多数FcPG未被发现在无花果中表达。
大约三分之一的FcPG在无花果果实发育和成熟过程中被转录，与桃果相似，45个PG家族成员中只有16个被检测到。
大多数未在无花果中表达的FcPGs也没有在营养组织的轮廓中表达。
即根，叶和芽，因此它们可能是假基因，就像一些拟南芥PGs一样。
无花果中表达的FcPGs转录本丰度在果实发育过程中表现出差异模式，从FcPG启动子的分析可以推断，一些PG表达可能是由ABA或乙烯等植物激素以及各种胁迫条件诱导的。
在果实表达的FcPGs中，转录本c43883_g4表现出独特的表达特征。
幼果中几乎没有c43883_g4的表达，但从成熟开始就迅速而持续地增加，当时其水平远高于其他FcPG。
.此外，c43883_g4是由乙烯利诱导的.转录本c43883_g4被注释为基因簇FcPG9，10，11，12，13，系统发育簇为FcPG1。
一般来说，串联重复区只有一个基因表现出相对较高的表达，而其他基因要么表达低，要么根本没有转录产物。
在我们的研究中，FcPG12与转录本c43883_g4最相似。
此外，当分别使用五个特异性引物检测五个PG基因的转录本时，仅鉴定出FcPG12转录本。
通过多克隆测序验证了没有扩增转录本的SNP碱基的纯FcPG12，并且在qRT-PCR中仅存在单峰熔解曲线。
综上所述，FcPG12是该基因簇果实发育过程中转录的主要成员。
爆炸比对分析表明，本研究中的FcPG12和FcPG39分别对应于先前在GenBank上报道和发表的FcPG1和FcPG2序列。
在系统发育树中，FcPG12聚集在进化枝C上，与该进化枝上其他物种的关键PG具有很强的同源性。
然而，它与进化枝B有遥远的关系，后者也携带许多关键的果实软化相关的PG。
1因此，似乎不同物种果实软化的关键PGs在不同的系统发育分支上。
FcPG12的相对分子质量为4.18 kDa，pI为8.73，与本文收集的其他物种的关键PG蛋白相似，如PpPG、PaPG和PdPG1。
序列相似性分析表明，PG结构域高度保守，但不同物种间PG蛋白序列差异较大。
为了获得FcPG12影响果实软化的证据，我们在图中对FcPG12进行了瞬时过表达。
PG酶活性的增加以及容器硬度的降低表明，FcPG12通过降解果胶在果实软化中起重要作用. 这与猕猴桃中AaPG18过表达的结果相似。
鉴定关键PG基因是改善果实贮藏和延长保质期的基础。
利用CRISPR/Cas9技术在番茄的SlPG基因中获得4 bp和10 bp缺失以及1 bp插入。
SlPG的移码突变导致氨基酸翻译提前终止，从而延缓果实软化。
另一项研究采用病毒诱导的基因沉默技术干扰桃β-半乳糖苷酶基因的表达，导致PpPG21和PpPME3表达降低及其相应的酶活性，抑制桃果软化。
MdPG1在'Royal Gala'苹果中的干扰导致果胶降解率降低，果实硬度增加。
作为无花果中关键的糖苷水解酶，调节FcPG12的表达可能是减缓果实快速软化和改善其质地的重要途径。
了解FcPG12表达调控对分析无花果成熟过程中软化机理具有重要意义。
FcERF5在果实软化过程中的表达模式与FcPG12相似，随着无花果开始成熟而增加。
FcERF5与AtERF5紧密聚集。
根据SWISS-PROT蛋白数据库中的相似性预测，FcERF5是一种可以与GCC盒结合的转录因子，并且可能是参与调节基因表达的信号转导途径的转录激活剂。
通过Y1H和双荧光素酶报告基因测定，我们验证了FcERF5通过与FcPG12启动子结合作为FcPG12的激活剂. 这与最近的一篇报道一致，即PpERF/ABR1通过与PpPG启动子结合来促进桃子中PpPG的表达。
FcERF5的亚细胞定位支持细胞核中调节过程的发生。
8FcERF5过表达后的果实硬度和PG酶活性与FcPG12过表达后相似，进一步证明FcERF5上调FcPG12并促进果实软化。
AP2/ERF是一个大家族，包括许多与图果成熟和软化相关的成员。
FcERF62也具有与FcPG12相似的表达特征。
FcERF62属于FcERF IV亚科。
FcERF62的表达随着果实发育而逐渐增加。
果实成熟时，果肉丰度最高，而在果皮中的表达量较低。
FcERF62在乙烯利处理的果实中表达增加。
然而，FcERF62对FcPG12的直接监管需要进一步验证。
除这些FcERFs外，加权基因共表达网络分析显示，共表达模块“MEcyan”和“MEblack”中的FcMYB108、FcMYB4、FcbHLH137、FcbHLH149和FcNAC29具有与FcPG12相似的表达特征。
据报道，RhMYB108与FcMYB108高度同源，参与乙烯和茉莉酸诱导的玫瑰花瓣衰老。
NAC基因家族成员在乙烯和ABA信号转导途径中起重要作用。
它们参与细胞壁修饰基因的精细调控，并在果实成熟和软化过程中的质构变化中发挥作用。
AtNAP与FcNAC29密切相关，可能在活性细胞分裂和细胞扩增之间的过渡中起作用。
在FcPG12启动子上预测MYB和NAC转录因子结合位点。
然而，需要更多的实验证据来揭示FcPG12表达调控的全景。
«——【·结论·】——»在这项研究中，首次在无花果基因组中鉴定出43个FcPG。
根据其基因结构、基序和顺式作用元件特性，分为7组。
基于RNA-Seq数据分析、基因克隆和序列比较，分离出FcPG12是与果实软化有关的关键PG。
瞬时过表达和qRT-PCR分析证实了FcPG12促进果实软化的功能。
FcERF5与细胞核中的FcPG12启动子结合并促进其表达，导致果实软化，正如亚细胞定位，Y1H，双荧光素酶和瞬时表达实验所证明的那样。
本研究结果为探索无花果软化的分子机制提供了依据，也为了解ERF在果实软化过程中如何调控细胞壁修饰PG基因转录提供了依据。
«——【·参考文献·】——»周琪，《脱落酸通过促进细胞壁代谢加速采后蓝莓果实软化.科学园艺》。
2021.布鲁梅尔DA，《果实软化和品质的细胞壁代谢及其在转基因植物中的操作》。
植物分子生物学. 2001Rose JK，《植物细胞壁纤维素 - 木葡聚糖网络的合作分解：细胞扩增和果实成熟之间的平行》。
趋势植物科学 1999。