流式细胞术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。
它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。
利用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、 DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。
流式细胞仪由4部分组成:(1)流动室及液流驱动系统;(2)激光光源及光束成形系统(3)光学系统有信号检测与存储、显示、分析系统;(4)细胞分选系统,可用于检测淋巴细胞群，监测细胞免疫状态,确定白血病/淋巴瘤免疫分型,HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系,干/祖细胞的定量及成分分析及黏附分子、TCR多态性检测,肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测,细胞内酶及耐药蛋白的分析等。
临床应用:疾病诊断,为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据;免疫调节如细胞因子，受体的相互作用,共刺激分子受体/配体的相互作用;发病机理,肿瘤的发病与机体的免疫力低下,以及信号传递障碍有关;药物/疫苗效果的评价;肿瘤生物治疗的时机选择以及效果监测;免疫状态评价如移植、放化疗等。
临床常用的流式细胞仪操作流程(一)BECKMAN COMLTER EPICS XL型流式细胞仪1.仪器开机(1)开机之前,分别将鞘液盒及清洁液盒加满鞘液和清洁液，废液桶倒净。
(2)打开稳压电源。
(3)开启计算机,仪器自动进入程序,启动流式细胞仪。
(4)打开电源箱门,检查WATER TRAP(水陷阱)、AIRFILTER(空气过滤器)、VAC- UUM FILTER(真空泵过滤器)。
(5)预热30min,仪器提示插入标本管。
(6)按“Protocol”选择需要的Protocol(程序),进行光路与流路检测。
(7)在QC-保养程序中记录。
2.光路、流路校准(1)将FLOW-Check液放在室温下10 min。
(2)按“Protocol”选择需要的Protocol(程序)。
(3)取0.5mL(15~20滴)FLOW-Check液放在塑料试管内。
(4)将试管放在进样台上,仪器自动取数至5000(FS)。
(5)核查FS及所有荧光信号(FL1、FL2、FL3、FL4)的HPCV(半峰宽CV)值,核对是否少于2%,是否与以前的记录相符。
(6)如FL1、FL2、FL3、FL4荧光信号的HPCV值超过2%,则应:1)观察仪器是否预热≥20 min。
2)按主机上“PRIME”键,排除气泡干扰后重测。
3)在Acquisition状态栏下,选择PANEL中的CLEANING-Panel,清洗机器后重测。
4)若以上处理后,HPCV仍未达标,应进行光路调整。
3.保养操作(1)日常清洗。
1)准备清洗液:次氯酸钠即5%次氯酸钠1mL+蒸馏水1mL等量混匀;蒸馏水5mL。
2)在Acquisition状态栏下,选择PANEL中的CLEANING-Panel。
3)按仪器提示,用次氯酸钠1次、蒸馏水3次依次放入标本台,仪器自动清洗。
(2)真空管清洗。
1)按“RUN”键,RUN键指示闪烁。
2)真空清洗器内加入5mL双蒸水(黑色管)。
3)将清洗器放置于样品台上,水被吸入。
4)拿下清洗器,按“CLEANSE”键，当清洗循环结束,RUN键指示灯亮,仪器显示Cy- tometer Ready,RUN灯亮。
(3)注意事项。
1)出现下述情况后必须立即进行清洗:使用以下染料后如 PI、EB、AO、TO、Coriphosphine-0、FITCFura3、FiuoresceinDiace- tate;使用以上染料，进行免疫分型前;如果有碎片或计数有明显增加。
2)连续工作24h至少关机一次。
3)重新启动激光必须在仪器关闭30min之后。
4)每 2~4周清洗一次空气滤膜。
5)每月清洗鞘液盒一次。
6)每60天清洗清洁液盒一次。
4.关机操作(1)完成日常清洗程序。
(2)完成真空管清洗。
(3)用70%酒精清洗标本台。
(4)将有双蒸水的试管放在样品台上。
(5)在Applications状态中的,选择“EXIT”退出system软件(6)若在DOS方式下开机,则在C:XL状态下键入“XLOFF”;若在WINDOWS 方式下开机,则返回WINDOWS 界面,双击“XLOFF”图标。
(7)依次关闭计算机主机、打印机以及电源箱开关。
(8)关闭 UPS。
5.参数设置(1)单色荧光分析的参数设置。
1)选择参数:在Acquisition状态栏下选择“| SETUP SCREEN”下的“Protocol”,于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成黄色,如FS、SS、FL1或FS、SS、FL2等。
2)选择参数后,可利用屏幕右上方的USERName将所选择的信号改成用户需要的名词,如将“FL1LOG”改为“FITC”,“FL2 LOG”改为“PE”等。
3)利用参数构建直方图:用鼠标将屏幕右上方的参数点亮,然后放在直方图的X、Y轴，创建需要的直方图。
4)设立分析区域:在Acquisition状态栏下选择“SETUP SCREEN”下的“RUN/REGION”,单击鼠标左键,将需要设立分析区域的直方图放大，将屏幕右下的 REGION EDIT”改为“CREAT”,在屏幕右侧选择分析区域类型,连续点击即可改变。
5)利用 GATING建立直方图之间的关系:在设立分析区域的界面下,返回多张直方图显示状态。
选择所需要的分析区域,如A,并将其点亮,放在所要GATED的直方图上方。
6)选择数据采集的停止方式、打印方式、存储方式。
7)存储分析参数:在Acquisition状态栏下选择“Protocol”下的“SAVE AS”,给此分析参数取名。
(2)双色荧光分析的参数设置。
1)选择参数:在Acquisition状态栏下选择“ SETUP SCREEN”下的“| Protocol’”,于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成黄色,如FS,SS,FL1,FL2。
2)选择参数后,可利用屏幕右上方的USERName将所选择的信号改成用户需要的名词,如将FL1 LOG 改为FITC或FL2LOG改为PE等。
3)利用参数构建直方图:用鼠标将屏幕右上方的参数点亮,然后放在直方图的X、Y轴，创建需要的直方图。
4)设立分析区域:在Acquisition状态栏下选择“SETUP SCREEN”下的“RUN/REGION”,单击鼠标左键,将需要设立分析区域的直方图放大,将屏幕右下的“REGION EDIT”改为“CREAT”,在屏幕右侧选择分析区域类型,连续点击即可改变。
5)利用GATING建立直方图之间的关系:在设立分析区域的界面下,返回多张直方图显示状态。
选择所需要的分析区域，并将其点亮,放在所要GATED的直方图上方。
6)选择数据采集的停止方式、打印方式、存储方式7)存储分析参数:在Acquisition状态栏下选择“Protocol”下的“SAVE AS”,给此分析参数取名。
(3)多色荧光分析的参数设置。
1)选择参数:在Acquisition状态栏下选择“SETUP SCREEN”下的“ Protocol”,于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成黄色,如FS、SS、FL1、FL2、FL3等。
2)选择参数后,可利用屏幕右上方的USERName将所选择的信号改成用户需要的名词,如将FL1 LOG 改为FITC,FL2 LOG改为PE等。
3)利用参数构建直方图:用鼠标将屏幕右上方的参数点亮,然后放在直方图的X、Y轴，创建需要的直方图。
4)设立分析区域:在Acquisition状态栏下选择“ SETUP SCREEN”下的“RUN/REGION”,单击鼠标左键,将需要设立分析区域的直方图放大，将屏幕右下的“REGION EDIT”改为“CREAT”,在屏幕右侧选择分析区域类型,连续点击即可改变。
5)利用GATING建立直方图之间的关系:在设立分析区域的界面下,返回多张直方图显示状态。
选择所需要的分析区域并将其点亮,放在所要GATED的直方图上方。
6)选择数据采集的停止方式、打印方式、存储方式。
7)存储分析参数:在Acquisition状态栏下选择“Protocol”下的“SAVE AS”,给此分析参数取名。
(4)细胞DNA周期及倍体分析参数设置。
1)选择参数:在Acquisition状态栏下选择“SETUP SCREEN’”下的“Protocol”，于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成黄色，如FS、SS、FL3、AUX(FL3Peak)、RATIO, TIME 等。
①选择 AUX参数时,须先将SIG点亮，并选择对数FL3Peak。
②选择RATIO对数时,须先将MUN、DEN点亮,并选择参数AUX、FL3,然后再点亮RATIO参数。
2)选择参数后,可利用屏幕右上方的USERName将所选择的信号改成用户需要的名词,如将“FL3LOG”改为“PI”。
3)构建直方图,用鼠标将屏幕右上方的参数点亮，然后放在直方图的X、Y轴,创建需要的直方图。
将所需要的分析直方图中“NO SAVE”改为“SAVE”。
4)设立分析区域:在Acquisition状态栏下选择“SETUP SCREEN”下的“RUN/REGION|”,单击鼠标左键,将需要设立分析区域的直方图放大,将屏幕右下的“REGION EDIT”改为“CREAT”,在屏幕右侧选择分析区域类型,连续点击即可改变。
5)利用GATING建立直方图之间的关系:在设立分析区域的界面下,返回多张直方图显示状态。
选择所需要的分析区域并将其点亮,放在所要GATED的直方图上方。
6)在直方图的上方点击一下,将出现一个对话框“Enter Histgram Title”,将所需要的标题写进即可。
7)选择数据采集的停止方式、打印方式、存储方式。
8)存储分析参数:在Acquisition状态栏下选择“Protocol”下的“SAVEAS”,给此分析参数取名。
(5)细胞免疫表型绝对计数参数设置。
CD34十细胞绝对计数的参数设置(ISHAGE方案):1)根据上面同样方法设门(ISHAGE方案)。
2)在Setup Screen栏中选择“Statics”，将随FLOW-COUNT提供的微球应用浓度输入校准因子区域。
3)标记3管全血标本:Tubel (trol/45/34)加10μL CD45-FITC、10μL CD34-PE; Tube2 (45/34)加10μL CD45-FITC、10μLCD34-PE;Tube3 (trol/45/G1)加10 μL CD45- FITC、10 μL IgG1-PE;三管都加50μL全血标本，然后在Tubel、Tube2中加入100μL Stem Trol。
混匀后室温避光15min，Q-Prep溶血。
4)振荡混匀 Flowcount,加100μL Flowcount到三反应管，注意不要带入气泡，并混匀，上机前必须重复振荡混匀一次。
5)上FCM分析,并计算各类CD34+细胞，包括内参照及全血标本。
标本上机后，当 CAL区域计数FLOWCOUNT达应用浓度以上,各区域统计数据中的COUNT 将自动转换为各分析区域绝对计数，单位为细胞数/pL。
StemTrol结果经标准化因子(100μL/20μL=5)校正,与Stem Trol提供的标准值比较,差异在士15%以内通过。
这样Tube2 测得的 CD34十细胞数为全血标本的绝对CD34十细胞数。
(6)数据分析。
1) DOS 状态下 SYSTEM软件数据存储方式有两种。
①在Acquisition 状态栏下选择“SETUP SCREEN”下的“Protocol”,于屏幕右下方用鼠标将“LIST SAVE OFF”改为“LIST SAVE ON”,即这种数据保存方式为LIST MODE,这种存储方式可重新进行设门分析。
②在Acquisition状态栏下选择“ SETUP SCREEN”下的“Protocol”,将直方图中“NO SAVE”改为“SAVE”,这种数据保存方式为HISTGRAM,这种存储方式为单张直方图存储,不可进行重新分析。
2)EXPO32软件分析。
①WINDOWS状态应用EXPO32分析软件,直接点击EXPO32分析软件快捷方式，软件即会显示所有用户。
②选择所需要的路径及密码,然后点击“NEXT”继续。
③直接点击“Finish”图标或已建立好的方案,开始运行EXPO32分析软件。